Page 26 - Srednje skole - radovi

POREĐENJE MOLEKULARNE I KONVENCIONALNE DETEKCIJE I

KVANTIFIKACIJE TAHIZOITA PARAZITA TOXOPLASMA GONDII

Autor: NATALIJA DIMITRIJEVIĆ, učenica II razreda gimnazije Sveti Sava
Mentor: Dr med TIJANA ŠTAJNER, istraživač saradnik,

Institut za medicinska istraživanja, Univerzitet u Beogradu
REZIME

Toksoplazmoza, infekcija izazvana parazitom Toxoplasma gondii, predmet je nepodeljene pažnje
mnogih istraživača, ne samo zbog zastupljenosti u čak trećini ukupne svetske populacije, već prevashodno
zbog teških, potencijalno životno ugrožavajućih posledica po kategorije stanovništva koje su, usled
nedovoljne zrelosti ili nedovoljne jačine imunskog odgovora, najosetljivije na infekciju (fetus i
imunokompromitovane osobe). Istraživački napori usmereni ka rasvetljavanju nepoznanica o samom
parazitu odnosno infekciji koju izaziva, u 21. veku su prevashodno fokusirani na razvoj i primenu
savremenih molekularnih metoda u cilju detekcije, kvantifikacije i bliže identifikacije T. gondii u telesnim
tečnostima ili tkivima domaćina.
Cilj ovog istraživanja bio je upoređivanje rezultata molekularne detekcije tahizoita T. gondii
primenom Real-Time PCR (qPCR) metode i određivanja njihovog broja uz pomoć standardne krive, sa
rezultatima dobijenim konvencionalnom metodologijom (direktna mikroskopija).
Kao materijal su korišćeni uzorci peritonealnog eksudata laboratorijskih miševa eksperimentalno
inficiranih intraperitonealnom inokulacijom tahizoita RH soja T.gondii.
Prisustvo tahizoita T. gondii u dobijenim uzorcima peritonealnog eksudata najpre je utvrđeno
mikroskopskim pregledom nativnih preparata, a njihov broj određen uz pomoć Bürker-Türk komore za
brojanje parazita. Potom je u istim uzorcima dokazivano prisustvo 529bp gena T. gondii, uz pomoć qPCR
metode korišćenjem visoko specifičnih prajmera i proba. Broj parazita, odnosno broj molekula parazitske
DNK potom je izračunat na osnovu Ct vrednosti, i to poređenjem sa Ct vrednostima standardne krive
konstruisane korišćenjem serije 10-strukih razblaženja uzoraka DNK RH soja T. gondii.
Rezultati ovog istraživanja ukazali su na nedvosmisleno preimućstvo savremene molekularne
metodologije nad konvencionalnom mikroskopijom, posebno kada treba detektovati i kvantifikovati T.
gondii u uzorcima sa malom koncentracijom parazita.

SUMMARY

Toxoplasmosis is an infection caused by Toxoplasma gondii, ubiquitous parasite that has been a
point of constant interest of researchers worldwide, not only because it infects one third of the global
population, but also because this infection may have a potentially life-threatening outcome in vulnerable
populations (fetus, immunossuppressed). Nowadays, research efforts are mainly directed towards
application of modern molecular methods aimed at detection, quantification and genotyping of T. gondii
in body fluids or tissues of different host species.
This research was aimed at comparison of detection and quantification of tachyzoites in T.
gondii RH strain-infected Swiss-Webster mice, using molecular (qPCR-derived standard curve method)
and conventional (direct microscopy) methods.
T. gondii tachyzoites were initially microscopically visualized and then counted, using Bürker-Türk
counting chamber. The same peritoneal fluid samples were tested by qPCR detection of 529 bp repetitive
element, using highly specific primers and probes. The number of T. gondii DNA was then calculated
based on the Ct values of tested samples, in comparison with the standard curve Ct values (constructed by
using 10-fold serial dilutions of T. gondii RH strain DNA samples).
The results obtained during this research pointed out the definite predominance of modern
molecular methods vs. conventional microscopy, especially when it comes to detection and quantification
of T. gondii in samples with low concentration of parasites.