Page 45 - tmp

Analiza ekspresije proteina β-aktina u tkivima i embrionima zebrice (Danio rerio)

Ana Sarić
Regionlni Centar za Talente Beograd II, anasaric29@gmail.com

zebrice, 30µL, 5. proteini izolovani iz srca zebrice, 20µL,,
1. Uvod 6. proteini izolovani iz srca zebrice, 10µL,, 7. Marker, 8.
proteini izolovani iz skeletnog mišiča zebrice 5µL, 9.
Za shvatanje bilo kog organizma potrebno je razumeti proteini izolovani iz skeletnog mišiča zebrice 10µL, 10.
unutrašnje stanje ćelije u različitim fazama njegovog proteini izolovani iz skeletnog mišiča zebrice 20µL.
razvića. Da je to moguće potrebno je pratiti aktivnost i
regulaciju sinteze proteina.
4. Rezultati istraživanja
Zebrica (Danio rerio) se sve češće koristi kao model sistem
za proučavanje toksičnosti različitih materija, potencijalnog Aktin je detektovan u svim nanetim uzorcima u različitim
dejstva novih lekova, ali i za izučavanje bolesti čoveka. količinama. U zavisnosti od količine nanetog uzorka i
Aktin, protein čija je ekspresija praćena u ovom radu, nalazi količine proteina u njima detektovane trake su slabijeg ili
se u svim eukariotskim ćelijama jer on, pored svojih jačeg intenziteta.
mnogobrojnih funkcija, učestvuje i u izgradnji citoskeleta.
Kod čoveka ovaj protein nalazi se u šest oblika od kojih je
jedan i β-aktin. Iako protein zebrice nije identičan proteinu
čoveka sličnost među njima je značajna što nas dovodi do Slika 1 – Izgled filma nakon detekcije
mogućnosti da antitelo napravljeno za humani β-aktin može
da detektuje i aktin zebrice. U nanetim uzorcima srca zebrice ima manje ukupnih
proteina nego u uzorcima mišića zbog čega su detektovane
2. Cilj rada trake slabije. U uzorku srca zebrice gde je količina proteina
bila najmanja (6) nije detektovana traka zbog male količine
nanetog uzorka.
Cilj ovog istraživanja bio je da se proveri da li antitelo Razlika u dužini trake pozitivne kontrole (uzorku humanog
napravljeno za humani β-aktin radi i na proteinu zebrice i proteina) i ostalih uzoraka može se pripisati razlici u
da li ono može da se koristi u daljim eksperimentima za veličini proteina, nepotpunoj denaturaciji ili nekim drugim
procenu količine proteina nanetih na gel.
faktorima, ali ona nije značajna za ovo istraživanje i ne
utiče na njegove rezultate.
3. Metoda rada
5. Zaključak
Jedna od metoda koja se koristi za praćenje ekspresije
proteina je Western blotting metoda. Uzorci ukupnih Primenom Western Blotting metodologije u ovom radu
proteina su izolovani iz tkiva srca i skeletnog mišića , kao i pokazano je da antitelo koje je napravljeno za humani
iz celih embriona zebrice. Nakon toga uzorci su protein β-aktin detektuje i aktin u tkivima i embrionima
denaturisani i razdvojeni elektroforezom u SDS zebrice, tako da se može uspešno koristiti u daljim
poliakrilamidnom gelu, pa prebačeni na membranu. Posle eksperimentima. Ovakvi rezultati su dobijeni zbog
transfera membrana je ostavljena u PBS puferu sa 0,01% evolutivne očuvanosti tj sličnosti aktina između čoveka i
Tween-om i 10% mlekom u prahu preko noći, čime se zebrice.
sprečava nespecifično vezivanje antitela za proteine na
membrani. Nakon toga je dodato primarno antitelo za β-
aktin koje se vezuje za specifična mesta u proteinu, a posle LITERATURA
pranja i sekundarno antitelo koje se vezuje za primarno i
sadrži „boju“ koja nam omogućava detekciju. Uzorci su [1] Perrin B, Ervasti J. The Actin Gene Family: Function
detektovani ECL supstratom na filmu. Follows Isoform Cytoskeleton,2010; 67:630–634.
Uzorci su nanošeni na gel u različitim koncentracijama. [2] Towbin H, Staehelint T, Gordon J. Electrophoretic
Njihov redosled na membrani (i gelu) bio je: 1. pozitivna transfer of proteins frompolyacrylamide gels to
kontrola, 2. proteini izolovani iz embriona 30µL, 3. proteini nitrocellulose sheets: Procedure and some applications
izolovani iz embriona 50µL, 4. proteini izolovani iz srca Proc.Natl. Acad. Sci. USA 1979; 76(9):4350-4354